Библиографическое описание:Влияние диффузионного ограничения на фотокислотные свойства флуоресцеина при физиологических значениях pH : отчет о НИР. - , 2023. - (Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами ; 22-22-00724). - Б. ц. - Текст : непосредственный.
Аннотация:Проведен сравнительный анализ спектрально-люминесцентных характеристик флуоресцеина в растворах при рН 6,50 в свободном состоянии и ковалентно-связанного с белком флуоресцеина-5-изотиацианата (FITC) с белками разного размера: лизоцимом белка куриных яиц (Lys, 14,3 кДа), карбоксиангидразой Б быка (BCA, 29 кДа), бычьим сывороточным альбумином (BSA, 67 кДа) и бактериальной люциферазой (Luc, 79 кДа). Выявлено различия между спектрами поглощения флуоресцеина в свободном и связанном состояниях, а также между характеристиками зонда, связанного с разными белками, на основе чего сделан вывод о смещении дианион-анионного равновесия флуоресцеина в приповерхностных областях белков по сравнению с таковым в объемном растворителе. По спектрам поглощения были рассчитаны фактические концентрации ионных форм и вычислены локальные значения рНlocal для белков: 7,05 для FITC-Lys, 6,25 для FITC-BCA, 6,35 для FITC-BSA и 6,01 для FITC-Luc. Был сделан вывод о том, что эффекты, оказываемые белками на сигнал флуоресцентного зонда, обусловлены электростатическими свойствами их поверхности: при рН 6,50 положительно заряженный Lys отталкивает протоны буфера, а отрицательно заряженные BCA, BSA и Luc – притягивают. В контрольных экспериментах установлено отсутствие влияния тех же белков, но без ковалентного связывания, на спектральные характеристики флуоресцеина в буфере с рН 6,50. Методами молекулярного моделирования установлено образование стабильных водородных связей атомов кислорода гидроксильной (О1) и карбонильной (О3) групп ксантенового кольца флуоресцеина с молекулами воды, как для флуоресцеина в свободном состоянии, так и для красителя, связанного с белками. Присутствие глицерина и сахарозы не изменяет заселённость водородных связей О1 (центра протонирования) и О3 с водой, хотя молекулы сорастворителей способны приближаться к О1 и О3 на достаточное расстояние и образовывать нестабильные связи, чаще всего одновременно с молекулами воды. Состояние гидратной оболочки флуоресцеина оценили по профилю функции распределения минимального расстояния (MDDF) для воды относительно поверхности красителя. Анализ выявил разное соотношение пиков первого и второго гидратного слоя (при 1,8 и 2,7 А соответственно) для моноанионной и дианионной форм флуоресцеина в свободном состоянии, а также снижение присутствия воды в гидратной оболочке FITC, связанного с белками, по сравнению с зондом в свободном состоянии, что наиболее сильно выражено для FITC-Lys. Исследована температурная зависимость ратиометрического pH-чувствительного сигнала флуоресцеина I488/I435 и получено, что в диапазоне 10-80 oС в буферном растворе pH 6,00 и 6,50 I488/I435(Т) носит линейный характер. Сочетанием экспериментальных и расчетных методов проведена оценка эффективности и направления влияния на величину углового коэффициента зависимости I488/I435(T) следующих механизмов: I. изменение ионного равновесия в основном состоянии; II. изменение ионного равновесия в возбужденном состоянии; III. изменение вероятности поглощения при длинах волн возбуждения 488 и 435 нм; IV. изменение квантового выхода флуоресценции. Установлено, что наибольшее влияние на температурную чувствительность I488/I435 оказывает механизм I: (константа равновесия смещается на 0,25 в сторону дианионов), а учет механизмов I-III позволяет получить зависимость, близкую к экспериментально наблюдаемой. Выявлено, что линейная зависимость I488/I435(T) сохраняется и в вязких средах (в буферных растворах с добавлением вязких агентов). Определены механизмы, обеспечивающие различающееся влияние растворов глицерина и сахарозы на угловой коэффициент I488/I435(T) флуоресцеина. В целом, установлено, что чувствительность ратиометрического сигнала к концентрации вязких агентов имеет опосредованный характер, напрямую не связанный с вязкостью раствора. Получена линейная корреляция температурной чувствительности ратиометрического сигнала с изменением молярной энтальпии реакции депротонирования флуоресцеина в присутствии вязких агентов.
Год издания:2023
Количество экземпляров:
Твёрдая копия издания отсутствует в фонде библиотеки
