Рациональный дизайн целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков с новыми свойствами с использованием методов мутагенеза и молекулярного моделирования : отчет о НИР
Библиографическое описание:Рациональный дизайн целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков с новыми свойствами с использованием методов мутагенеза и молекулярного моделирования : отчет о НИР / Е. С. Высоцкий. - , 2022. - (Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами ; 22-14-00125). - Б. ц. - Текст : непосредственный.
Аннотация:Согласно плану 2022 г., за отчетный период разработана реляционная база данных PhotoProteinTech, содержащая информацию о последовательностях и физико-химических свойствах целентеразин-зависимых люцифераз и кальций-регулируемых фотопротеинов, а также данные по температурам плавления, спектрам излучения и биолюминесцентной активности. База данных реализована с помощью СУБД MySQL 5.7.26 и состоит из 10 взаимосвязанных таблиц. На данном этапе она содержит информацию о светочувствительном Са2+-регулируемом фотопротеине беровине из Beroe abyssicola и его 78 мутантах, Са2+-регулируемых фотопротеинах акворине и его 96 мутантах и обелине и его 87 мутантах из Aequorea victoria и Obelia longissima, соответственно, целентеразин-зависимой люциферазе Renilla и ее 130 мутантах, а также данные по белкам с похожим типом укладки и наличием гомологии к кальций-регулируемым фотопротеинам (865 белков) и к люциферазе Renilla (11535 белков), обнаруженных в базе данных предрасчитанных структур AlphaFold DB. Таким образом, уже сейчас база данных содержит информацию, необходимую для оценки влияния мутаций на физико-химические свойства фотопротеинов и люциферазы Renilla, и может быть использована для дизайна новых мутантов с измененными биолюминесцентными свойствами. С использованием методов молекулярного моделирования и искусственного интеллекта (пакеты Rosetta, AlphaFold, DeepAccNet, ESM-IF1, ProteinMPNN) предсказаны аминокислотные замены в люциферазе Renilla, которые могут привести к изменению спектра излучения и биолюминесцентной активности люциферазы Renilla, кинетики биолюминесцентной реакции, а также повысить термостабильность фермента. На основе предсказанных замен с помощью сайт-направленного мутагенеза получены четырнадцать мутантов люциферазы Renilla (#2 - K189A, E162N, F180Y; #4 - L165T, M154D; #5 - K209P; #6 - F33H; #7 - A54P; #9 - H62N; #10 - H142F, S145A; #11 - I266E, T276Q, F273W; #13 - W104L, F105W, L50Q, P76C, I34M; #15 - V267R, E256D; #16 - Y243W; #17 - I266D; #18 - S145G, V147Y, G269I, F127L, S123V, I266N; #19 - D148G, V149P, G269F, N241S) и исследованы их биолюминесцентные (удельная активность, спектр излучения, кинетика реакции) и физико-химические (термостабильность, термоинактивация) свойства. Среди исследованных мутантов выявлено четыре (#2, #4, #9 и #19) наиболее устойчивые к действию температуры. Показано, что мутант #2 сохраняет 100% активности после 3-часовой инкубации при 37оС. Помимо запланированных на 2022 г. исследований для светочувствительного кальций-регулируемого фотопротеина беровина ктенофор Beroe abyssicola определены: удельная биолюминесцентная активность, квантовый выход биолюминесцентной реакции, а также коэффициенты экстинкции для высокоочищенного активного белка. Данные характеристики беровина будут необходимы для решения задач, запланированных на 2023 г. Кроме того, получены кристаллы кальций-разряженного обелина-v (активированного аналогом целентеразина, целентеразином-v) и определена с разрешением 2.1 Å его пространственная структура. Установлено, что основным продуктом реакции является целентерамин-v, а не целентерамид, когда в качестве субстрата используется нативный целентеразин. Поскольку целентерамин может образовываться в результате «темнового» пути распада диоксиэтанона, обнаружение целентерамина-v как основного продукта реакции, инициированной кальцием, объясняет низкую биолюминесцентную активность кальций-регулируемых фотопротеинов с этим аналогом целентеразина. Наряду со структурой активного обелина, связанного с 2-гидропероксицелентеразином-v, определенной нами ранее, пространственная структура кальций-разряженного обелина-v с продуктом реакции в активном центре будет необходима для выполнения исследований по моделированию взаимодействия целентеразина-v с кальций-регулируемыми фотопротеинами, запланированными на 2023 г.
